双荧光素酶检测

双荧光素酶报告基因通常以萤火虫荧光素酶为报告基因，以海肾荧光素酶为内参基因。所构成的报告系统具有灵敏度高、动态范围广、应用灵活等优势，广泛应用于基因调控、非编码RNA靶向互作等研究领域。

技术原理

荧光素酶报告基因是指以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)。

将目的基因转录调控原件构建入带有荧光素酶(Firefly luciferase)的表达载体，构建成报告基因质粒，使这段序列调控luciferase的转录表达。然后将报告基因质粒转染细胞，给予其不同的处理后裂解细胞，并加入底物荧光素(luciferin)，luciferase可催化luciferin发出荧光(最强波长在560nm左右)。检测得到的荧光值高低可以判断不同处理组对该转录调控原件的影响。为避免由于质粒转染细胞时效率差异所造成的误差，通常会转入Renilla luciferase的报告基因质粒作为内参(最强波长在465nm左右)，即双荧光报告系统。

实验流程

应用方向

1、验证microRNA同mRNA靶向互作。

将待测基因的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，检测荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列。

2、验证microRNA同lncRNA靶向互作。

将待测lncRNA序列插入报告基因载体的3’UTR区域，检测荧光素酶活性。

3、启动子结构分析。

将启动子区域(约2k左右)进行分段截短或突变，构建入报告基因载体，检测荧光素酶活性。

4、启动子SNP分析。

一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。

5、验证信号通路是否激活。

将该信号通路的下游相应原件序列构建入报告基因载体，检测不同上游条件下，其荧光素酶活性，即下游信号通路的响应情况。