单细胞转录组测序

10x Genomics的Chromium Controller是基于微流控技术的单细胞文库制备系统，可以同时获得100-80,000个单细胞文库，通过高通量测序实现对数百个至数万个细胞进行细胞鉴定和基因表达分析。10x Genomics单细胞转录组测序可应用于多种细胞类型，如肿瘤细胞、免疫细胞、干细胞、生殖细胞、胚胎细胞等，是研究肿瘤异质性、免疫细胞群体和胚胎发育等的好方法。

实验流程

一、文库制备流程

首先要获得单细胞悬浮液，并对单细胞悬液进行活性检测，细胞活性>90%方可进行后续实验。为保证后续细胞的捕获效率，要求细胞浓度控制在700-1200cell/ul范围内。文库制备过程中，包含着连接有cell barcode和UMI（unique molecular identifier）的引物序列的Gel Bead和细胞被“油滴”包裹，形成GEM（Gel Bead in Emulsion），细胞在这个反应体系中溶解，并完成反转录，形成全长cDNA序列。接着破碎油滴并纯化后，cDNA文库进行PCR扩增，并连接测序引物。文库制备过程如下图所示：

二、上机测试

文库构建完成后，先使用Qubit3.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用Agilent 2100 对文库的insert size进行检测，insert size符合预期后，对文库的有效浓度进行准确定量（文库有效浓度＞10nM），以保证文库质量。质量合格的文库用Illumina平台进行测序，测序策略为PE150。

分析流程

10x Genomics单细胞转录组测序标准信息分析流程主要分为三部分：测序数据质控、CellRanger 3进行基因表达定量与细胞鉴定、Seurat 3进行表达矩阵过滤、数据降维、聚类及可视化、差异表达基因分析及功能注释。10x Genomics单细胞转录组测序的主要生物信息学分析流程如下：

部分结果展示

A:Cell Ranger 数据统计

B:细胞聚类（cluster）分析 C:细胞类型注释

D:各细胞群中marker基因表达

案例分析

案例分析：疾病与细胞亚型相联系--对肺囊肿纤维化疾病生物学的新认识

样品:气管组织的气道上皮细胞;

单细胞文库:~1,500 细胞文库 ,总共分析了7,193个细胞;

测序:Illumina测序仪

生信分析软件:Cell Ranger, Seur

文章亮点：

使用已知的marker基因共获得7种聚类； 其中一种聚类的表达模式与非洲爪蟾和斑马鱼皮肤中的离子 细胞 （ Ionocytes ）类似，发现新的肺细胞类型—肺离子细胞; 鉴定极端罕见的细胞类型 (0.5%); 亚细胞群特异的新转录因子； 将疾病类型与细胞亚型相关联（通过疾病标志基因）； Ionocytes 表达 > 50% of CFTR（囊性纤维化跨膜传导调节蛋白）