T细胞受体（TCR）测序

T细胞受体库测序（T cell receptor repertoire sequencing，TCR-Seq）是以生物信息学（Bioinformatics）全面高速分析高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）检测靶向扩增后的T细胞抗原识别决定性表面分子，即T细胞受体（T cell receptor，TCR）多样性的检测技术，用以揭示机体在生理和病理状态下T细胞介导的细胞免疫应答（T cell-mediated immune response）状态改变。

T细胞介导的细胞免疫应答过程中，抗原呈递细胞（antigen-presenting cell，APC）摄取抗原（Ag）、消化形成抗原-MHC分子复合物，并呈递给T细胞。T细胞通过自身T细胞受体β链中V-D-J基因重排后的CDR3β参与抗原识别。

TCR的基因由可变区（V）、多变区（D）、结合区（J）和恒定区（C）四部分基因片段组成，形成互补决定区（complementarities determining region, CDR）和间隔的4个骨架区（framework region, FR），基因结构如下图所示。在T细胞发育过程中CDR1、2和FR区域相对保守，CDR3区由V、D和J 进行重排而形成具有功能的TCR编码基因（T细胞克隆），由于V（65~100种）、D（2种）、J（13种）基因片段本身具有多样性，此外，由于在重排的过程中，在VD及D-J的连接区经常有非模板的核苷酸的随机插入或删除，进一步增加了CDR3区的多样性。这种基因片段连接的不准确性使TCR的表达呈多样性，以识别各种不同的抗原。

TCR基因结构，左：α链基因结构，右：β链基因结构

TCR-seq常用于评价各种免疫相关疾病和遗传性突变引起的某个物种所有T细胞或特定T细胞激活介导的细胞免疫反应中TCR基因重排碱基序列，以及各序列的丰度，用于研究不同T细胞克隆的转录情况和相互间关系，从而揭示更深层次的T细胞功能特异性，继而解释免疫应答机制、免疫耐受原因，免疫调节形式等相关生命现象。

TCR测序的应用方法包括：（1）肿瘤免疫治疗后的监测和治疗指导，（2）抗感染免疫治疗效果和耐受性评估，（3）移植排斥反应中急性排斥反应的预测和干预指导，（4）自身免疫疾病的临床试验和科学研究，（5）感染性和神经可塑性疾病的生物标志物。

建库方法及技术流程

技术优势

• 检测TCR的RNA序列。与DNA分析相比，可以更为全面和准确地获得某一状态下TCR的多样性信息。

• 基于5’RACE的方法。5’RACE相较于MPCR测序方法，可以检测到更多的V-J pairing的多样性，同时具有更低的偏好性和较高的准确性。

• 数字标签（UMI）技术帮助绝对定量。通过UMI标签去除PCR扩增重复、排除PCR偏好性影响，准确分析TCR克隆的丰度，实现绝对定量。

• 引入校准机制，准确分析TCR的多样性。TCR的高度多样性使得其对测序数据错误极为敏感，PCR和测序错误都可能被误认为序列的突变或重排，因此必须加入校准机制。UMI技术除了实现准确定量，还可纠正PCR和测序错误，锁定真实序列。

• PE150和PE250测序可选：PE250测序完整覆盖TCR全长，同时检测CDR1/2/3，全面研究CDR1/2对MHC的亲和力影响；PE150测序，靶向CDR3区，测序价格更为经济实惠。

案例展示

TCR测序发现肿瘤组织中TCR多样性降低

通过TCR-seq获得α链和β链全长序列信息，发现大部分细胞的TCR 中α链和β链都是唯一的（unique）。拥有一对完全一样的α链和β链可能来源于同一祖细胞，α-β链配对模式为3个以上细胞共有的情况，作者将其定义为扩增克隆（clonal）。正常组织和外周血中发现的克隆TCR只占总CD8+T细胞的10%左右，而在肿瘤组织中，该比例高达约30%。与外周血或癌旁组织相比，肿瘤组织CD8 +T细胞的TCR克隆要高得多，在调节T细胞中也发现了类似的富集现象，这可能是由于肿瘤病灶处的T细胞被激活并增殖导致的。

肝癌肿瘤组织中，有两个甚至多个克隆TCR的T细胞比例升高

肿瘤微环境内的T细胞易于发生耗竭或调节T细胞发生抑制，在肝细胞癌（HCC）肿瘤微环境中的肿瘤浸润细胞，效应CD8+T细胞更少，而耗竭细胞更多。且越是晚期的患者，T细胞的耗竭趋势越明显。克隆的T细胞群（含有4个以上的克隆细胞）也更多的表现出耗竭趋势。